Die Möglichkeiten des Auffindens und Identifikation von Pathogenen haben sich durch die Entwicklung molekularbiologischer Techniken wesentlich geändert. Obgleich die Kultivierung des Erregers nach wie vor den Goldstandard in der Erregerdiagnostik darstellt, haben sich molekularbiologische Methoden bei vielen diagnostischen Fragestellungen als Bestätigungsmethode bewährt. Weitere Indikationsbereiche für den sequenz-basierten Nachweis von Erregern sind das langsame Wachstum von Bakterien, die Diagnostik von Erregern mit atypischen biochemischen Eigenschaften sowie von Erregern, deren Kultivierung bisher nicht gelungen ist.
Die Entwicklung von Techniken der genomischen Sequenzbestimmung, der Amplifikation von Erreger-Nukleinsäuren sowie die zunehmende Kenntnis charakteristischer, konservierter Genomregionen, durch welche auf phylogenetische Beziehungen zurückgeschlossen werden kann, bedingt, dass ständig neue und zuvor uncharakterisierte Mikroorganismen identifiziert werden. Das Potential dieser Techniken hat zu einer explosionsartigen Identifizierung von Sequenzen bisher nicht, oder nur schwer kultivierbarer mikrobieller Erreger aus pathologischen Geweben geführt.
16.10.2005 - Aufspüren neuer Infektionserreger durch genotyp-basierte Identifikation
Große Fortschritte in den letzten Jahren
Um die Identifikation neuer Mikroorganismen zu ermöglichen, sollte eine genetische Sequenz in einer möglichst großen Anzahl bekannter Organismen konserviert sein. Jede konservierte Gensequenz, welche sich in einer kohärenten Gruppe von Mikroorganismen findet, kann als so genannte "priming site" für die Amplifikation ansonsten unbekannter Sequenzen mittels PCR (RT-PCR) dienen. Sequenzen des rDNA-Genkomplexes sind unter allen mikrobiellen Organismen verbreitet und konserviert und können zuverlässig die Stammesgeschichte der Organismen vorhersagen. Man erhält hochspezifische Informationen über die Entwicklungsgeschichte eines putativen, mikrobiellen Pathogens, und somit dessen taxonomische Position in Relation zu anderen bekannten Organismen.
Darüber hinaus erhält man die Sequenzinformation selbst, von welcher ausgehend spezifische Primer und Hybridisierungs-Sonden hergestellt werden können. In Bakterien wird zur Identifikation unbekannter Organismen die PCR mit "broad-range" Primern im Bereich von Sequenzen der "small subunit ribosomal RNA" oder-DNA (ssu rDNA) des rDNA-Genkomplexes durchgeführt. Durch diese Methode konnte unter anderem der bislang nicht charakterisierbare Erreger der bazillären Angiomatose (Katzenkratzkrankheit) in erkranktem Gewebe identifiziert werden.
Trotz des Potentials der molekularbiologischen Technologien bleibt jedoch die biologische Bedeutung, solch einer neu identifizierten Nukleinsäuresequenz in Abwesenheit eines isolierten intakten Mikroorganismus unklar, da eine experimentelle Reproduktion der Erkrankung mangels Kenntnis eines zugehörigen Erregers nicht möglich ist. Wie auch die traditionellen Kultivierungstechniken ermöglicht die Technologie der Nukleinsäureamplifikation zwar die Entdeckung neuer Mikroorganismen, ob diese jedoch tatsächlich als Pathogene im Wirtsorganismus wirksam sind, oder dort als transiente oder permanente Kommensalen bzw. opportunistische Erreger leben, bleibt unklar.
Die in situ Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik eröffnet die Möglichkeit, eine Assoziation der Sequenz eines bestimmten Mikroorganismus mit der entsprechenden zellulären Pathologie herzustellen, und liefert außerdem Informationen über die subzelluläre Lokalisation des viralen Genoms sowie der entsprechenden mRNA.
Eine weitere Methode zur Detektion sowie zur sequenz-basierten Charakterisierung von Mikroorganismen, die nicht aus dem Wirtsorganismus zu isolieren sind, ist die so genannte "representational difference analysis" (RDA). Diese Methode basiert auf der selektiven Anreicherung seltener DNA-Fragmente, welche sich nur in einer von zwei ansonsten identischen DNA-Populationen finden. Mittels dieser Methode konnte z.B. erstmals das GB-Virus-Typ C (frühere Bezeichnung: Hepatitis G-Virus) identifiziert werden. Auch der verursachende Erreger des Kaposi-Sarkoms, das humane Herpesvirus Typ 8 wurde mit Hilfe dieser Technik entdeckt.
Für die Erfassung der Sequenzen komplexerer Genome, wie zum Beispiel zur Identifizierung neuer Bakterien und Pilze, oder zur Identifizierung unbekannter oder neu erworbener pathogener Eigenschaften bzw. Gene mittels Konsensus-Sequenzen von Familien virulenz-assoziierter Gene, bietet sich die Technologie der DNA-Microarrays an, durch welche die Sequenzen komplexer Genome untersucht und verglichen werden können.
Viele Familien virulenz-assoziierter Gene und Genprodukte sowie ihre Angriffsorte, sind mittlerweile durch bereits bekannte Konsensus-Sequenzen vorhersagbar. Die Vorhersage allerdings, ob ein Mikroorganismus auf dessen Präsenz anhand amplifizierter genomischer Fragmente geschlossen wird, die Ursache der jeweils untersuchten Erkrankung darstellt, ist sehr viel problematischer, da kein replizierender Organismus zur Analyse der Erregereigenschaften (zum Beispiel Resistenzen) und zur Reproduktion der Erkrankung zur Verfügung steht.
Der erforderliche Beweis eines kausalen Zusammenhanges zwischen entdeckter mikrobieller Sequenz und der untersuchten Erkrankung kann daher nur auf Ergebnissen beruhen, die eine relativ starke und spezifische Assoziation, Dosis-Effekte, die Wirksamkeit gezielter therapeutischer Maßnahmen sowie eine lokale Assoziation der mikrobiellen Sequenz mit dem betroffenen Gewebe (z.B. in situ Hybridisierung) zeigen (Prof. Dr. med. Tino F. Schwarz, Gelbfieber-Impfstelle, Facharzt für Labormedizin, Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie, Würzburg).
© Medizinische Enzyklopädie 2010